Bakteri Actinomyces sp. merupakan bakteri yang cukup banyak ditemukan di bagian saluran akar gigi sedangkan Lactobacillus acidophilus merupakan bakteri yang paling dominan di dalam rongga mulut. Bakteri tersebut sangat berperan dalam terjadinya karies gigi. Salah satu pencegahan karies gigi yang dapat dilakukan yaitu menggunakan obat kumur. Zat aktif yang biasa digunakan yaitu Chlorhexidine. Penggunaan Chlorhexidine dalam jangka panjang tidak diperbolehkan karena efek samping yang sangat merugikan sehingga diperlukan alternatif antibakteri dari bahan alam untuk mengurangi efek samping tersebut. Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai antibakteri adalah seledri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ekstrak etanol seledri terhadap pertumbuhan bakteri Actinomyces sp dan Lactobacillus acidophilus. Penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratorium untuk melihat aktivitas antibakteri ekstrak etanol seledri dengan konsentrasi 12,5%; 25%; 50%; dan 100%. Metode ekstraksi yang digunakan yaitu maserasi dengan pelarut etanol 96%. Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara in vitro dengan menggunakan metode difusi cakram disk terhadap bakteri Actinomyces sp dan Lactobacillus acidophilus serta membandingkan zona hambat yang terbentuk dari masing-masing perlakuan dengan kontrol positif obat kumur “Minosep”. Analisa data yang digunakan yaitu metode statistik One way Anova. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etanol seledri memiliki respon hambatan yang sama dengan kontrol positif yaitu kategori kuat terhadap bakteri Actinomyces sp dan Lactobacillus acidophilus. Berdasarkan uji One way Anova menunjukan adanya perbedaan yang signifikan dari masing-masing perlakuan yang dibuktikan dengan nilai (p=0,000). Kesimpulan dari penelitian ini adalah ekstrak etanol seledri memiliki aktivitas antibakteri terhadap Actinomyces sp dan Lactobacillus acidophilus dengan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) masing-masing 12,5% dengan rata-rata zona hambat 10,21 mm dan 10,79 mm.