Infeksi nosokomial merupakan salah satu penyebab meningkatnya angka morbiditas dan mortalitas di rumah sakit. Salah satu parameter pelayanan kesehatan yang baik di rumah sakit adalah terkendalinya infeksi nosokomial. Perawat adalah tenaga kesehatan mayoritas ada di lingkungan rumah sakit serta memiliki interaksi yang lebih sering pada pasien dan beresiko menularkan infeksi. Upaya untuk memutus rantai transmisi infeksi adalah dengan menjaga kebersihan tangan (hand hygine). Kondisi lingkungan kerja memberikan peranan penting terhadap baik buruknya kinerja yang dihasilkan. Faktor eksternal yang dapat mempengaruhi adalah lingkungan kerja yang meliputi motivasi, beban kerja, fasilitas, supervisi. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis lingkungan kerja dengan perilaku hand hygiene perawat di ruang rawat inap Rumah Sakit TK. III. 04. 06. 03. dr R Soetarto Yogyakarta. Penelitian dengan metode deskriptif analitik dengan pendekatan cross sectional, sampel yang diteliti menggunakan teknik sampel purposive dengan jumlah sampel 40 orang perawat. Analisis data yang digunakan adalah uji chi square. Dari hasil dioeroleh 32 responden (80%) yang berpendapat lingkungan kerja mendukung dengan 27 reponden (84, 4%) perilakuhand hygiene baik dan sebanyak 5 responden (15, 6%) dengan penerapan hand hygiene yang cukup baik; sedangkan 8 responden (20%) yang berpendapat lingkungan kerja cukup mendukung dengan 1 reponden (12, 5%) perilakuhand hygiene baik dan sebanyak 7 responden (87, 5%) dengan penerapan hand hygiene yang cukup baik. Berdasarkan hasil analisis uji chisquare diperoleh hasil nilai p value adalah 0.000< 0.005, artinya ada hubungan yang signifikan antara lingkungan kerja dengan perilaku hand hygiene perawat di ruang rawat inap Rumah Sakit TK. III. 04. 06. 03. dr R Soetarto Yogyakarta. Kesimpulan dari penelitian ini adalah ada hubungan antara lingkungan kerja dengan perilaku hand hygiene perawat di ruang rawat inap Rumah Sakit TK. III. 04.06. 03. dr R Soetarto Yogyakarta.