El objetivo de este estudio fue determinar la prevalencia de las cepas de Staphylococcus aureus (S. aureus) en los trabajadores de un hospital de la ciudad de Cali. Se realizó un estudio descriptivo, con muestras de rastreo nasal y frotis de piel a 30 trabajadores de salud. La caracterización se basó en el análisis del antibiograma y la amplificación por PCR de los genes mecA y agr. El origen del aislamiento se estableció con el análisis del gen agr, al identificar los grupos agr. 11 (26,7 %) trabajadores estuvieron colonizados por S. aureus. La frecuencia de S. aureus fue mayor en el personal de salud que se encontraban en la sala de cirugía (20%; OR = 2,077; P>0,05). Se identificaron cuatro antibiotipos, esta característica es compatible con los clones comunitarios que han demostrado ser altamente diversos con una gran capacidad de diseminación en la comunidad. El 36,4% de los aislamientos presentaron resistencia a cefotaxima y/o oxacilina, fenotipo sugerente de S. aureus resistente meticilina (SARM), en estos aislados se identificó el gen mecA. El grupo agr i se encontró, principalmente, entre los aislamientos sensibles a meticilina (SASM), compatible con un origen comunitario y en los aislamientos SARM pertenecen al grupo agr ii, siendo de origen hospitalario. Se demostró la prevalencia de S. aureus con resistencia a los antibióticos que colonizan al personal de salud, principalmente los que laboran en la sala de cirugía. Se debe mantener el control regular del personal para impedir la diseminación de patógenos.