Die Festkçrper-NMR-Spektroskopie hat sich zu einer nützlichen Methode zur Bestimmung von Proteinstrukturen entwickelt. Im Unterschied zu Streumethoden bençtigt die NMR-Spektroskopie keine Proben mit langreichweitiger Ordnung, und neben Mikrokristallen [1] sind Viren,[2] Fibrillen,[3] Membranproteine [4] und große Proteinkomplexe [5] untersucht worden. Trotzdem ist die Probenvorbereitung von entscheidender Bedeutung, um hochaufgelçste Spektren zu erhalten, und sowohl Auflçsung als auch Empfindlichkeit bleiben ein zentrales Thema. Wir zeigen hier, dass das Sediment eines großen Biomoleküls (12 59 kDa), das direkt in einen NMR-Rotor zentrifugiert wurde, hochaufgelçste Spektren mit gutem Signal-Rausch-Verhältnis ergibt, welche der Spektrenqualität sorgfältig kristallisierter Präparationen nahekommen. Bertini und Mitarbeiter [6] zeigten kürzlich, dass der NMR-Rotor als Ultrazentrifuge genutzt werden kann und dass sich Lçsungen großer Proteine bei genügend hohen Rotorfrequenzen wie Festkçrper verhalten, allerdings ist bei dieser Art von Experiment die Empfindlichkeit durch die Lçslichkeit des Proteins begrenzt [6a] und bleibt niedrig. Wir demonstrieren hier, dass das Problem des Signal-Rausch-Verhältnisses gelçst werden kann, indem man eine Proteinlçsung mit einer Ultrazentrifuge mit speziell adaptierter Füllvorrichtung direkt in den NMR-Rotor sedimentiert und dabei Proteindichten erhält, die vergleichbar sind mit mikrokristallinen Proben. Direktes Zentrifugieren in NMR-Rotoren wurde schon früher angewendet, um die Konzentration von kristallinen und fibrillären Proben zu erhçhen.[7] Hier sedimentieren wir lçsliche Proteine mit einer ähnliche

Methode und çffnen damit einen Zugang zur Erforschung von Proben, die schwer kristallisierbar sind oder schwer mit Fällungsmitteln wie PEG (Polyethylenglycol) ausgefällt werden kçnnen. Der Ansatz liefert eine ausreichende Empfindlichkeit für die Untersuchung von großen Proteinen, wie am Beispiel der 59 kDa große DnaB-Helicase gezeigt wird. DnaB-Helicasen sind bakterielle ATP-getriebene Enzyme, die doppelsträngige DNA während der DNA-Replikation entwinden. DnaBs sind im Allgemeinen hexamer und bilden ringfçrmige Aggregate, welche die einsträngige DNA umschließen. In unserer Studie untersuchten wir DnaB aus Helicobacter pylori mit einer monomeren Atommasse von 59 kDa (57 kDa plus Aufreinigungs-Tag). Die Kristallstruktur der N-terminalen Domäne wurde in früheren Studien gelçst (Lit.[8], PDB-Code 3GXV), wie auch kürzlich diejenige der C-terminalen Domäne des Proteins.[9] Biochemische und elektronenmikroskopische Untersuchungen des Volllängenproteins zeigten, dass es–im Unterschied zu den anderen DnaBs–Dodekamere bildet, die aus Paaren hexamerer Ringe zusammengesetzt sind.[9] Die Kristallstruktur des Volllängenproteins ist nicht verfügbar. Die von DnaB erhaltenen Kristalle sind bisher für Rçntgenkristallographie ungeeignet, liefern aber Festkçrper-NMR-Spektren hoher Qualität (siehe unten). Das DnaB-Dodekamer hat eine Atommasse von 708kDa. Alternative Präparationen des Proteins sind von Interesse, um die Konformation in Gegenwart von DNA oder anderen Wechselwirkungspartnern zu untersuchen, bei deren Vorhandensein die Kristallisierung nicht erfolgreich war.