Latar belakang: Daun belimbing wuluh memiliki potensi besar sebagai obat tradisional, diantaranya sebagai antiradang, antibatuk, antihipertensi, mengobati ulkus lambung dan antiinfeksi. Menguji aktivitas dari fraksi terstandar marker flavonoid (rutin) yang aktif menghambat bakteri Staphyllococcus aureus. Daun belimbing wuluh diekstrak dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70%, fraksinasi ekstrak kental menggunakan metode ekstraksi cair-cair dengan corong pisah. Aktivitas antibakteri diuji dengan sampel fraksi semipolar dengan konsentrasi 10%, 7, 5% dan 5%. Uji kualitatif KLT terhadap sampel fraksi dengan pembanding rutin sebagai marker golongan flavonoid untuk mengkonfirmasi keberadaan senyawa golongan flavonoid dalam fraksi. Fraksi semi polar menunjukkan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan S. aureus dengan zona hambat terbesar 11 mm pada konsentrasi fraksi 10%. Pola kromatogram dari fraksi aktif menunjukkan adanya noda pada Rf yang sama dengan standar rutin Simpulan dan saran: Fraksi semi polar terstandar rutin memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan S. aureus pada konsentrasi 10%, 7, 5% dan 5%. Perlu identifikasi dan karakterisasi lebih lanjut senyawa yang muncul dalam pemisahan KLT