Kulit limau kuit di Kalimantan Selatan Indonesia umumnya hanya dibuang begitu saja sebagai limbah, padahal dalam kulit limau kuit mengandung senyawa kimia yang berpotensi sebagai agen antibakteri. Kulit limau kuit mengandung komponen utama beta pinen senyawa yang telah terbukti mempunyai efek antibakteri dengan cara menghambat sintesis DNA, serta kulit limau kuit juga memiliki kandungan flavonoida, fenolik dan terpenoida paling tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar ekstrak etanol kulit limau kuit (Citrus hystrix DC) yang optimal dalam menghambat beberapa bakteri. Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas antibakteri sediaan pada bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode replika dan metode difusi kertas cakram. Hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak kulit limau kuit pada konsentrasi 100%, 75%, dan 50% dapat menghambat bakteri, namun yang paling optimum menghambat bakteri adalah pada konsentrasi 100% untuk bakteri Escherichia coli zona hambat sebesar 10, 67 mm dan 14 mm pada Staphylococcus aureus.